月度归档： 2019 年 2 月

德克萨斯大学分子生物科学研究所 马千惠

台湾大学生命科学系 陈俊宏教授

过去四年来CRISPR/Cas9基因编辑技术，被广泛使用于基础科学以及临床前实验。 Cas9 酵素在引导RNA (guide RNA) 序列带领下，可以切断特定的基因位置，造成双股DNA的断裂，细胞侦测到受损的DNA会起动修补机制，可以大幅提高基因同源重组的效率，使得编辑各种细胞和器官的基因变得容易且快速。在医学研究上，科学家们致力于应用此技术来发展具有潜能的治疗方式，包括治疗遗传疾病、癌症以及感染性疾病等。

艾滋病的病原体是人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV-1），目前仍持续危害大众的健康，全球有超过四千万的人感染艾滋病，而且每年以多于两百万人感染的速度增加中。目前广泛使用俗称「鸡尾酒疗法」的联合反转录病毒疗法(Combination antiretroviral therapy, cART) 来抑制活跃的病毒复制，减缓病情的发展，降低发病率和死亡率，但是仍然没有办法痊愈，而且一旦停止用药，病毒会自行开始复制，造成病情恶化。其主要原因是HIV-1病毒具有躲避并且长期潜伏在体内的特性，HIV-1病毒会从其单股RNA反转录出双股DNA，并且嵌入病人基因体内，使免疫系统无法察觉，非常难从病人体内完全清除干净。美国天普大学路易斯卡兹医学院 (Lewis Katz School of Medicine at Temple University) 和匹兹堡大学研究团队的最新研究成果，有了突破性的发展。研究显示利用 CRISPR/Cas9 技术，可以有效地将潜伏在动物DNA中的 HIV-1 病毒基因移除，去除后续感染的状况。此研究团队最先以三种实验动物，来进行此壮举实验的团队。研究成果于2017年五月初刊登于Molecular Therapy期刊 。

延续该研究团队于 2016年发表的论文，当时成功地将大部分嵌在基因转殖大鼠及老鼠器官组织的 HIV-1病毒基因片段移除掉。新的研究结果则更加明确，而且经过改良的CRISPR/Cas9系统效率更高，更成功地使用于三种活体实验动物中。研究人员使用腺相关病毒(AAV) 载体输送系统，选择AAV-DJ 和AAV-DJ/8两种载体，可以传送至更多种组织和器官，同时承载四种不同的引导RNA转录单位，以及来自菌种Saphylococcus aureus 比较小的Cas9 (简称为saCas9)基因，将此基因编辑载体以静脉注射的方法打入老鼠体内，再送到不同的标的细胞。研究人员成功地将基因转殖老鼠 (HIV-1 Tg26 trangenic mouse) 基因体内的 HIV-1 DNA 切断移除，减少病毒基因大约 60到 95%的 RNA表现量，进一步证实他们先前的研究结果。另外将此系统送入两种不同的实验老鼠也同样可行，其中一种实验老鼠是感染EcoHIV 病毒(相当于人类的HIV-1病毒），正处于急性感染的状况，他们成功地以此技术阻断病毒复制，进而预防系统感染。清除病毒的效率在肝细胞可达到 96%，证明可以用CRISPR/Cas9系统进行预防性治疗并且根除病毒。第三种实验动物是移植有人类细胞于各个组织器官的人类化老鼠(BLT mice)，同时感染HIV-1病毒，处于长期为了判断这策略是否成功，研究团队测量HIV-1病毒的RNA表现量，同时使用由Won-Bin Young 博士新开发的活体生物发光影像系统，准确地显示受HIV-1 感染的细胞在动物体内分布的位置和存在的时间，让研究人员可以同步观察病毒复制以及其潜伏在受感染细胞和组织的情况。比较治疗组和对照组，可以看到经由 CRISPR/Cas9 治疗的老鼠其病毒指标明显减少，表示策略成功!

总结来说，新的治疗方式以腺相关病毒（AAV) 为运送系统，将改良过包含有四种引导RNA及saCas9的基因编辑载体，成功地运送至各个组织器官，进而有效地移除嵌在寄主细胞基因体内的HIV-1病毒基因。避免病毒以突变方式躲掉侦测，达到完全的治疗效果。

研究团队对他们的研究发现感到兴奋，也对下一步的研究表示乐观。下一个阶段将是在灵长类动物重复整个实验过程，可以更加了解去除病毒的状况，并且了解病症的演变。最终目标是在临床上运用到病人身上，给予艾滋病患完全痊愈的治疗 。潜伏感染状况。令人惊叹的是，仅仅一次治疗，即成功地将潜伏在不同组织器官内的病毒基因片断移除。

聚合酶链反应技术

聚合酶链反应原理

DNA 的半保留复制时，双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在 DNA 聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝，在实验条件下，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，并设计引物作启动子，加入 DNA 聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。聚合酶链反应（PCR） 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性、退火（复性）、延伸三个基本反应步骤构成。

1. 模板 DNA 的变性模板 DNA 经加热至 94℃ 左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
2. 模板 DNA 与引物的退火（复性）模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 40～60℃ 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。
3. 引物的延伸  DNA 模板引物结合物在 DNA 聚合酶的作用下，于 72℃ 左右，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按照碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环就可以获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可以成为下次循环的模板，每完成一个循环需 2～4 min，2～3 h 就能将待扩目的基因扩增放大好几百万倍。

常用 PCR 技术

1. 反向 PCR 技术（inverse PCR，IPCR） 反向 PCR 是克隆已知序列旁侧序列的二种方法。主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组 DNA，酶切片段自身环化，以环化的 DNA 作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的 DNA 片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基因侧翼 DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板 DNA、再通过反向 PCR 获得未知片段。
2. 锚定 PCR 技术（anchored PCR，APCR） 用酶法在一通用引物反转录cDNA 3’-末端加上一段已知序列、然后以此序列为引物结合位点对该 cDNA 进行扩增，称为 APCR。
3. 不对称 PCR 技术（asymmetric PCR） 两种引物浓度比例相差较大的 PCR 技术，即为不对称 PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度，常用（50～100）：1的比例。在最初的 10～15 个循环中主要产物还是双链 DNA 。但当低浓度引物被消耗尽后，高浓度引物介导的 PCR 反应就会产生大量单链 DNA。
4. 反转录 PCR 技术（reverse transcription PCR，RT-PCR） 当扩增模板为 RNA 时。需先通过反转录酶将其反转录为 cDNA 才能进行扩增。应用非常广泛，无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。
5. 巢式 PCR 技术（NEST PCR） 先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量·然后再用一对内引物扩增以得到特异的 PCR 带，此为巢式 PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式 PCR，为减少巢式 PCR 的操作步骤，可将外引物设计得比内引物长些，且用量较少，同时在第一次 PCR 时采用较高的退火温度，而第二次采用较低的退火温度。这样在第一次 PCR 时，由于较高退火温度下内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物。经过若干次循环，待外引物基本消耗尽，无需取出第一次 PCR 产物，只需降低退火，即可直接进行 PCR 扩增。这不仅减少操作步骤，同时也降低了交叉污染的机会。这种 PCR 称中途进退式 PCR，主要用于极少量 DNA 模板的扩增。
6. 多重 PCR 技术（multiple PCR） 在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段，如果基因的某一区段有缺失，则相应的电泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。
7. 重组 PCR 技术 重组 PCR 技术是在两个 PCR 扩增体系中，两对引物分别由其中之一在其5′-端和3′-端引物上带上一段互补的序列，混合两种 PCR 扩增产物，经变性和复性，两组 PCR 产物互补序列发生粘连，其中一条重组杂合链能在 PCR 条件下发生聚合延伸反应，产生个包含两个不同基因的杂合基因。
8. 原位 PCR 技术 利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行 PCR 扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。
9. 实时荧光定量 PCR 技术 以 DNA 探针链接荧光试剂，待此 DNA 探针与 PCR 产物结合，检测荧光量，利用荧光信号积累实时检测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线，以计算机软件分析，确定样品中的 DNA 或者 RNA 的原始模板拷贝数量。

重组DNA技术

重组 DNA 技术（recombinant DNA technique）是指在体外重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。这种操作可把特定的基因组合到传学研究开辟了崭新的途径。载体上，并使之在受体细胞中增殖和表达。因此，不受亲缘关系限制，为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。

重组 DNA 技术步骤一般包括：① 获得目的基因；② 与克隆载体连接，形成新的重组 DNA 分子；③ 用重组 DNA 分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④ 对转化子筛选和鉴定；⑤ 对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

目的基因的制备

目的基因的制备，最常见的是已知序列和分布的基因，可用 PCR 等方法从组织或 cDNA 文库中克隆出感兴趣的基因；或者从中间载体比如克隆载体上将已知基因用酶切等方法切下，然后连接到目的载体上。这里介绍从 cDNA 文库中获取目的基因的方法。此法的基本原理是先构建 cDNA 文库（包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部 mRNA 经反转录而合成的 cDNA 序列的克隆群体，它以 cDNA 片段的形式储存了全部的基因表达信息），然后筛选含有目的 cDNA 的克隆。

接合反应

DNA 连接的方法主要有黏端连接法和平端连接法。在DNA连接酶的作用下，有\(Mg^{2+}\) 、 ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源 DNA 分子连接在起，而且能使平末端的双链 DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比黏性末端的连接效率低，一般可通过提高 T₄ 噬菌体连接酶浓度或者增加 DNA 浓度来提高平端的连接效率。

细菌转化

细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是，在 0℃ 下的 CaCl₂ 低渗透溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的 DNA 形成不易被 DNA 酶所降解的羟基-钙磷酸复合物，此复合物黏附于细菌表面。42℃ 短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收 DNA 复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得以表达，然后再涂布于含有氨苄西林的选择性平板上，37℃ 培养过夜，这样即得转化菌落。

菌落筛选

一般情况下，质粒上常带有可供筛选使用的标记，例如，抗性基因或蓝白筛选系统元件等，这些足以对克隆成功与否做出初步判断。下一步可以根据所插入的片段的特性，例如，质粒大小及酶切位点，来确定其是否带有插入片段。

菌种培养保存和复苏

微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或者相对静止的状态，这样才能在一定时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

基因转染技术

将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持生物功能，称为基因转染。基因转染技术将特定的遗传信息传递到真核细胞中。目前，将外源 DNA 导入真核细胞的方法大致可分为两类：物理化学方法和生物方法。物理化学方法常用的有磷酸钙法。DEAE-葡聚糖法、电穿孔法、脂质体法等；，生物方法是以病毒为载体，通过病毒感染的方法将外源 DNA 转入细胞，常用反转录病毒和腺病毒转染。

化学转染法

1. 磷酸钙共沉淀法将氯化钙、DNA 和磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙微沉淀，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用进入细胞质。该方法的转化效率通常很低。
2. 脂质体染法    脂质体能在体内或体外提供运载外源性遗传物质进入细胞的载体。脂质体介导的基因转移的最大优势在于能在活体内应用。

生物方法

1. 直接注射法 将含有 DNA 的溶液直接注射到肌肉，以引起邻近的细胞摄入 DNA 入链进行表达，在肌细胞中，基因表达可持续数月。
2. 受体介导的基因转移 依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外源基因。受体介导的基因转移方法是在质粒 DNA 和某种特异的多肽（配体）之间形成复合体，而这种多肽能为细胞表面的受体所识别。若将 DNA 在体内运送至肝内，可以将 DNA 和能与肝细胞受体特异结合的去唾液酸糖蛋白质偶联，以便通过细胞内吞过程而被摄入，这种 DNA 大部分被肝脏所摄取。应用该方法转移的外源基因在活体内的表达持续时间较短，在评估实际应用前景上还存在一些问题。
3. 精子载体法 用精子和 NDA（吡啶核甘酸辅酶）一起孵育，可捕获得 DNA。通过受精过程，将外源性基因导入受精卵，大大简化了转基因动物的制备过程。这项转染方法是才发展出来应用于鱼类转殖的最新技术，它的最大优点就是简单方便。

核酸杂交

核酸分子杂交原理

DNA 分子是由两条单链形成的双股螺旋结构，维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，DNA 分子成为单链，这一过程称做变性或融解。加热、改变 DNA 融解的 pH 值、有机溶剂等理化因素，均可使 DNA 变性。变性的 DNA黏度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。在温度升高引起的 DNA 变性过程中。DNA 的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的中点被称做融解温度 \(T_{m}\)。\(T_{m}\) 值的大小取决于核酸分子的 G-C 含量，核酸分子的 G-C 含量越高，其 \(T_{m}\) 值越高。因为 G-C 碱基之间有三个氢键，而 A-T 碱基之间只有两个氢键。变性 DNA 只要消除变性条件，具有碱基互补的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称做复性。根据这一原理，将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构、这一过程称做杂交（hybridization）。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就可以形成杂交体。

核酸分子杂交类型

固相杂交

固相杂交是把欲检测的核酸样品先结合到某种固相支持物上，再与溶解于溶液中的杂交探针进行反应，杂交结果可用仪器进行检测，但大多数情况下直接进行放射自显影，然后根据自显影图谱分析杂交结果。

1. 菌落杂交 用于重组细菌克隆筛选的固相杂交，称做菌落杂交。主要步骤包括菌落平板培养，滤膜灭菌后放到细菌平板上，使菌落黏附到滤膜上，将滤膜放到经适当溶液饱和的吸水纸上，菌斑溶解产生单链的 DNA，固定 DNA 用 \(^{32}P\) 标记的单链探针与菌落 DNA 进行杂交。杂交后，洗脱未结合的探针，将滤膜暴露于 X 射线胶片进行放射自显影。将自显影胶片与滤膜、培养平板比较就可以确定阳性菌落。
2. Southern 杂交 Southern 杂交是从环境样品中提取细菌总 DNA，用适当的限制性核酸内切酶切割，经凝胶电泳分离后，将凝胶中的条带转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后对该膜进行探针检测的方法。只有含有靶 DNA 序列的 DNA 分子才能与特定的核酸探针进行杂交。 Southern 杂交主要用于研究某些细菌多态性变化规律。
3. Northern 杂交 Northern 杂交和 Southern 杂交的过程基本相同，区别在于靶核酸是 RNA 而非 DNA。RNA 在电泳前已经变性，进一步经历变性凝胶电泳分离后，不再进行变性处理。在 Northern 杂交中所使用的探针常常是克隆的基因。

液相杂交

液相杂交是一种研究最早且操作简便的杂交类型。液相杂交的反应原理和反应条件与固相杂交基本相同，仅仅是将待检测的核酸样品和杂交探针同时溶于杂交液中进行反应，然后利用羟磷灰石柱选择性结合单链或双链核酸的性质，分离杂交双链和未参加反应的探针，用仪器计数并通过计数分析杂交结果，或者利用核酸分子的减色性（260nm处吸光度的降低与双链形成的多少成正比）分析杂交的结果。

原位杂交

原位杂交是应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术。其中在此技术上发展的荧光原位杂交（FISH）技术因其经济、安全、无污染、探针稳定、快速、简便、直观、可靠、灵敏度高、信号强、背景低等，在诊断生物学、发育生物学、细胞生物学、遗传学和病理学研究上均得到广泛的应用。

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